RNA-seq对lncRNA检测的局限性-给我免费播放片高清在线观看生物丨数谱生物

RNA-seq对lncRNA检测的局限性

LncRNAs一般表達水平較低，且在低水平即可发挥功能，常常被高丰度的RNAs所遮蓋（图1A和1B）[1]。 RNA-seq對於lncRNA檢測存在嚴重的侷限性。

由於lncRNAs丰度低和缺少全長註釋信息，导致lncRNAs的定量不準。

如果僅僅是定性檢測一個lncRNA，少量的可重复测序reads即可滿足需求。然而，由于RNA-seq數據過於分散而導致的Poisson誤差，要实现精准定量，至少需要数百个reads [2]。然而，一般lncRNA的表達丰度只有mRNA的十分之一不到[3]。常规RNA-seq在定量檢測這些低丰度lncRNA分子時通常表現不佳，无法满足差异表达分析的要求[1,4]（图1C和1D）。尽管增加RNA-seq測序深度可以在一定程度上改善對錶達量較高的轉錄本的檢測，如mRNA，但是对低丰度的转录分子lncRNA則效果不顯著。即使不计成本增加测序深度（虚线曲线，将普通20M RNA-seq的測序深度提高數百倍），仍有一大部分（40%）转录本不能被准确定量（图1 C）[4]。此外，RNA-seq中所使用的FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）计算方法需要lncRNA轉錄本模型的精確長度，而很多lncRNA註釋目前仍缺少全長序列信息[5]。相反，lncRNA芯片寡核苷酸探針以高親和性雜交靶RNA，不受其它高丰度RNA的影響，即使对于低丰度lncRNA，也具有高灵敏度，能够实现对其精确定量[6] (圖1D) 。

圖1.（A）lncRNA的表達中值比mRNA低10倍（参考GENCODE數據）[3]。（B）前1%的高表達基因（比如看家基因）占据了约40%的RNA-seq信號，而低表达的lncRNA只有很少的信號覆蓋 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [1]。（C）在一个典型的测序深度为40 M的mRNA-seq中，只有不到10%的lncRNA能夠被可靠定量（D）当RNA水平較低時，RNA-seq的定量誤差變得不可接受，而芯片持续表现良好[6]。

RNA-Seq對剪接體覆蓋度差，通常缺少跨越剪接位点的reads，难以准确检测lncRNA轉錄本異構體

lncRNA一般有多個轉錄本異構體，且不像mRNA一樣有保持連續開放閱讀框的限制，因此组装更灵活和模块化[1]。不同异构体与其mRNA靶基因之間存在不同的基因組位置關係和調控關係。因此，在转录本水平检测lncRNA非常重要。然而，RNA-seq對剪切異構體，特别是那些非主流异构体的覆盖度差且不均衡[1] （图2.A）。即便测序覆盖度达到饱和，实现转录本异构体的准确重新组装也面临内在性的挑战。由于reads較短，不能在距离较远的外显子之间建立有效关联 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [1]，使得重新组装lncRNA轉錄本異構體和實現定量變得十分困難 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [7-10]。而lncRNA芯片上的轉錄本特異性探針是根據成熟的轉錄本異構體模型而設計，能够精确可靠地对转录本异构体实现检测和定量（图2.B）。

圖2 （A）与表达水平较高的mRNA相比，低水平的lncRNA不能被RNA-seq的短Reads充分覆盖，不足以重新组装外显子模型，也无法实现定量[1]。（B）Arraystar lncRNA芯片转录本特异性探针（红色）可以准确、特异性的区分和定量具有不同致癌功能的转录异构体，如BCL2L1基因的不同转录本BCL-XL, BCL-XS, 和ENST412972。与之相比，基因特异性探针（紫/黄/绿色）无法区分不同转录本。箭头代表转录方向。

RNA-seq數據分析缺少公共lncRNA數據庫，无法快速的系统性注释和分析lncRNA

不像蛋白編碼基因已具有成熟的參考數據庫，RNA-seq目前仍缺少公共的完善可靠的參考數據庫，以用于原始测序数据的序列比对和注释。此外，RNA-seq 的短reads 在5’末端或3’末端覆蓋度不均一，且经常存在RNA降解、或者逆转录过程不能完整的复制至RNA 5’末端等因素，导致lncRNA在5’或3’末端註釋不完整[1]。

Arraystar lncRNA芯片基於高質量的轉錄組和lncRNA數據庫，对各种来源的lncRNA進行了全面收集，包括所有权威数据库、高分文章以及通过独家自有收集流程所得到的lncRNA。相比其他平台，芯片注释更丰富，更详细，更全面。

表1. lncRNA芯片與RNA-seq在lncRNA表達譜檢測上的比較

Arraystar LncRNA 芯片	RNA-Seq
高灵敏度、高精准的定量lncRNAs检测，即使每个细胞中只有1个lncRNA 拷贝也可被检测	大部分表达水平低的lncRNA不能被准确、可靠的定量检测
天然地具备链特异性检测能力，同时检测sense和anti-sense lncRNA	需要预先构建链特异性测序文库，方可进行链特异性检测
明确、特异地检测lncRNA转录本异构体	检测lncRNA转录本异构体灵敏度低、准确性差
Arraystar lncRNA芯片包含自建的高质量的lncRNA数据库、系统而详细的注释以及功能分析，同时囊括全部mRNA编码基因	缺乏公共的lncRNA参考数据库，无法对RNA-seq数据进行快速的系统性注释和分析

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參考文獻

1. Deveson, I.W., et al., The Dimensions, Dynamics, and Relevance of the Mammalian Noncoding Transcriptome. Trends Genet, 2017. 33(7): p. 464-478.
2. Anders, S. and W. Huber, Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol, 2010. 11(10): p. R106.
3. Derrien, T., et al., The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Res, 2012. 22(9): p. 1775-89.
4. Labaj, P.P., et al., Characterization and improvement of RNA-Seq precision in quantitative transcript expression profiling. Bioinformatics, 2011. 27(13): p. i383-91.
5. Uszczynska-Ratajczak, B., et al., Towards a complete map of the human long non-coding RNA transcriptome. Nat Rev Genet, 2018. 19(9): p. 535-548.
6. Zhang, X., et al., Maternally expressed gene 3 (MEG3) noncoding ribonucleic acid: isoform structure, expression, and functions. Endocrinology, 2010. 151(3): p. 939-47.
7. Consortium, S.M.-I., A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nat Biotechnol, 2014. 32(9): p. 903-14.
8. Liu, Y., et al., Evaluating the impact of sequencing depth on transcriptome profiling in human adipose. PLoS One, 2013. 8(6): p. e66883.
9. Steijger, T., et al., Assessment of transcript reconstruction methods for RNA-seq. Nat Methods, 2013. 10(12): p. 1177-84.
10. Baruzzo, G., et al., Simulation-based comprehensive benchmarking of RNA-seq aligners. Nat Methods, 2017. 14(2): p. 135-139.

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