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基因芯片技術服務 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 RNA m6A甲基化测序(MeRIP Seq) |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR(MazF酶切法)技术服务 |
基因芯片技術服務 DNA甲基化芯片 DNA羟甲基化芯片 ChIP-chip |
NGS测序技术服务 DNA甲基化测序 DNA羟甲基化测序 染色質免疫共沉澱測序 |
PCR技术服务 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
蛋白相對定量 TMT标记定量技术 非標定量技術 |
蛋白修飾 TMT标记定量磷酸化 非標定量磷酸化 |
RNA/蛋白-蛋白相互作用 RNA-蛋白相互作用 蛋白-蛋白相互作用 |
寧波大學醫學院龔朝輝教授團隊主要從事腫瘤分子生物學研究。今年,該研究團隊應用Arraystar lncRNA芯片篩選發現了一個在肺癌中異常上調的lncRNA——JPX,該lncRNA分子通過與miR-33a-5p結合而充當Twist1的ceRNA,影响肿瘤的大小、TNM分期和肺癌的轉移。进一步深入研究表明,JPX是通過調節miR-33a-5p/Twist1,参与了Wnt/β-catenin信號的激活,进而促进了EMT過程,最终影响了肺癌的发生發展。该研究提示JPX/miR-33a-5p/Twist1軸可能具有治療肺癌的潛力,具有作为药物作用靶点的潜力。该研究成果发表在Molecular Cancer上(IF:15.302)上。(芯片實驗由给我免费播放片高清在线观看生物丨数谱生物提供技术服务)
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肺癌是最惡性的癌症之一,其5年生存率根據階段和地區差異在4%至17%之间变化。尽管近年来在肺癌的诊断和治疗方面已经取得了许多进展,但是晚期肺癌的转移仍然是导致高死亡率的主要原因。因此,需要阐明新的致癌途径,精确靶向治疗肺癌。
長非編碼RNA(lncRNA)是一类长于200個核苷酸的RNA分子,对癌症的发生、发展有重要影响。异常表达的lncRNA與各種類型的癌症的發生和發展有關,在lncRNA-miRNA-mRNA調控網絡中,lncRNA充當特定mRNA的競爭性內源RNA(ceRNA),调节靶基因,影响基因表达。然而,肺癌中最异常表达的lncRNA的功能和機制尚不清楚。
Twist1是一種重要的轉錄因子,可介导上皮-間質轉化(EMT)进展和肿瘤转移。此外,Wnt/β-catenin信號傳導是EMT和癌症轉移的關鍵驅動因素。作者以前的研究表明,miR-33a-5p負調控Twist1,从而抑制了非小细胞肺癌(NSCLC)的侵袭和转移,miR-33a-5p可以作爲早期肺癌診斷的潛在生物標誌物。
因此,作者考虑lncRNA是否可以與miR-33a-5p和Twist1形成ceRNA網絡以參與肺癌的EMTs和惡性發展過程。
技術路線
研究思路
LncRNA高通量篩選及PCR驗證
爲了篩選到影響肺癌患者疾病進程的lncRNA分子,作者選擇了4對人類肺癌組織和癌旁組織樣本,应用Arraystar Human LncRNA芯片篩選差異表達的lncRNA,共篩選出1551個差異表達的lncRNA,其中817個lncRNA表達上調,734個lncRNA表達下調(图1A)。
接下來,使用miRNA-lncRNA相互作用數據庫Starbase預測可能與miR-33a-5p相互作用的lncRNA。结果显示61個lncRNA存在miR-33a-5p結合位點。这61個lncRNA與1551個差異表達的lncRNA取交集後發現,lncRNA JPX既在腫瘤樣本中表達量出現異常升高,又通过互补碱基对的七个连续配对与miR-33a-5p相互作用(图1B)。
RT-qPCR檢測116對肺癌組織和癌旁組織中的JPX表達量,结果显示肺癌组织中的JPX表達明顯高於癌旁組織(图1C)。回归分析表明,116例肺癌患者中,JPX的表達與腫瘤大小和TNM分期密切相關(图1D)。
圖1. Arraystar Human lncRNA芯片筛选结果及验证
A. 四對肺癌組織和癌旁組織的差異表達的lncRNA。
B. 紅色表示肺癌中表達量上調的lncRNA,绿色表示表达量下调的lncRNA。蓝色表示StarBase數據庫預測可能和miR-33a-5p有結合的lncRNA數據集。结果的重叠处为lncRNA JPX。
C. RT-qPCR檢測到116個配對的肺癌相對於癌旁組織JPX相對錶達量上調。
D. RT-qPCR分析四種肺癌細胞系(SPC-A-1,LTEP-a-2,A549,NCI-H1299)相对正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)中JPX相對錶達量上調
爲了研究JPX的生物學功能,使用重组质粒提高JPX在肺癌細胞系中表達,使用siRNA特異性敲低JPX在肺癌細胞系中表達。结果表明,JPX體外過表達促進了肺癌細胞的生長和增殖(图2A,2B,2C),而JPX敲低則抑制了肺癌細胞的生長和增殖。另一方面,利用伤口愈合实验和Transwell分析實驗,检测JPX對肺癌細胞遷移和侵襲的影響。结果表明,JPX小鼠體內過表達可以增強肺癌細胞的遷移和侵襲(图2D),而JPX敲低則抑制了肺癌細胞的遷移和侵襲。
圖2. JPX体外过表达促进肺癌细胞的生长和增殖,增强肺癌细胞的迁移和侵袭能力
A. 進行CCK-8檢測,分析JPX過表達後肺癌細胞的生存力增強。
B. 集落形成分析法檢測JPX過表達後肺癌細胞的增殖能力增強。
C. 裸鼠種植穩定表達JPX的NCI-H1299細胞後,肿瘤生长能力增强。
D. 通過Transwell法檢測到JPX過表達後細胞的侵襲能力增強。
機制研究
爲了揭示JPX和miR-33a-5p協同調控肺癌進程的生物學機制,首先利用核质分离实验(Nuclear-cytoplasmic fractionation)得到JPX主要定位在肝癌細胞的細胞質中,进一步利用双荧光素酶报告基因实验(dual-luciferase reporters assay)、RT-qPCR、Pearson相關分析,表明JPX發揮ceRNA調控機制,在肺癌细胞中发挥mir-33a-5p海綿的功能,通过靶向结合miR-33a-5p間接調控靶基因(图3A,3B)。体外细胞水平回补JPX的實驗結果表明JPX通過調控miR-33a-5p,促进肺癌细胞增殖,迁移和侵袭的能力(图3C,3D)。
圖3. JPX發揮ceRNA調控機制,在肺癌细胞中作为海绵,靶向结合miR-33a-5p
A. 在miR-33a-5p共轉染的細胞中,突变的(MUT)JPX報告質粒的相對熒光素酶活性明顯高於野生型(WT)质粒。
B. RT-qPCR檢測到敲除JPX後miR-33a-5p相對錶達量上調。
C. 通過傷口癒合實驗檢測JPX過表達對miR-33a-5p介導的細胞遷移抑制的回補效應。
D. 通過Transwell檢測到JPX過表達對miR-33a-5p介導的細胞侵襲抑制的回補效應。
由於已知研究表明miR-33a-5p負調控其靶基因Twist1,作者进一步研究JPX和Twist1在肺癌中的關係。对95對肺癌組織和癌旁組織樣本檢測的結果表明,Twist1在肺癌組織中高表達。Pearson相關分析表明,在肺癌患者中,JPX表達與Twist1正相關(图4A)。在肿瘤模型小鼠中,RT-qPCR顯示,JPX表達在腫瘤組織中顯著上調。JPX過表達誘導腫瘤組織中,Twist1在RNA和蛋白質層面(图4B)表达均增加。总体而言,数据表明JPX和Twist1在肺癌進程中協同上調。
另一方面,已知Wnt/β-catenin信號通路是EMT的驅動器,通过蛋白免疫印迹研究表明,JPX通過調節miR-33a-5p/Twist1,激活Wnt/β-catenin信號傳導,介导的EMT進程(图4C,4D)。
圖4. JPX/miR-33a-5p/Twist1通过激活Wnt/β-catenin途径促进肺癌细胞的EMT进展
A. RT-qPCR檢測Twist1在JPX表達量高的臨牀樣本中的相對錶達量上調。
B. 蛋白免疫印跡檢測到過表達JPX的SPC-A-1和NCI-H1299細胞系中,Ecadherin,N-cadherin,Vimentin,Twist1,GSK-3β和β-catenin的表達量。
C. 蛋白免疫印跡檢測si-CTNNB1+pcDNA3.1-JPX轉染後SPC-A-1細胞中β-catenin,E-cadherin和N-cadherin的表達量。
D. 蛋白免疫印跡檢測si-Twist1+pcDNA3.1-JPX轉染後的SPC-A-1細胞中GSK-3β和β-catenin的表達量。
總結全文,研究结果表明,JPX/miRNA-33a-5p/Twist1軸可作爲新的ceRNA調控網絡,通过激活Wnt/β-catenin信號通路參與EMT過程,从而加速了肺癌的恶性进程。这些研究结果提示,JPX可以作爲潛在的治療靶標和精準診斷和治療肺癌的新型生物標誌物。
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-020-1133-9
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