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單細胞測序技術服務 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 單細胞全轉錄組測序 |
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生物分子凝聚體研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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RNA-蛋白相互作用 HyPro - MS CHIRP – MS RNA pull-down MS |
RNA-RNA/DNA相互作用 HyPro-seq/芯片 CHIRP-seq |
蛋白-RNA相互作用 AGO APP seq/芯片 RIP-RNA seq/芯片 |
蛋白-蛋白相互作用 CoIP-MS |
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NGS测序技术服务 R-loop 测序分析服务 |
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NGS测序技术服务 環狀DNA测序 |
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基因芯片技術服務 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 表觀轉錄組學測序服務 RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 MeRIP-PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）技术服务 |
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Ribo-seq Ribo seq |
核糖體-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC联合mRNA-seq |
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蛋白表達定量 Label free非标定量技术 TMT标记定量技术 PRM靶向定量 |
Small RNA测序已被用于分析microRNA和其它small RNA。然而，RNA修饰的干扰、文库扩增的偏差、数据分析不准确….等诸多问题限制了Small RNA测序的效率和准确性。Arraystar Small RNA芯片能有效解决这些挑战，在总RNA需求量更低的情况下，依旧以高灵敏度和准确度同时分析全谱small RNA。
通過測序進行small RNA定量检测的挑战
·来自RNA修饰的干扰
在small RNA测序文库构建过程中，small RNA内部的修饰（例如m1A、m3C和m1G）会阻碍反转录反应进而中止cDNA合成，导致获得的序列偏向启动端，最终导致构建无偏倚全长序列文库的失败。例如，由于tsRNA TΨC环区域中存在m1A修饰的阻碍，small RNA-seq通常识别18nt 3'tsRNA，但遗漏了由Northern Blot检测到的更主要的22nt tsRNA异构体。
·文库扩增的偏差
在small RNA定量过程中，为了产生足够量的cDNA进入测序仪，small RNA测序需要对文库进行PCR扩增[1]。然而，如图1所示，RNA的G/C含量、序列组成、二级结构、长度、PCR的启动以及反应条件都可能导致PCR产物丰度的偏差和扭曲[2]。因此，small RNA测序并不能对RNA进行有效的绝对定量，其结果还需使用正交方法进行验证。
圖 1. cDNA构建所涉及步骤的图示，包括潜在的偏差来源。 (A) 具有不同5’ 端和3’ 端修饰的非蛋白质编码RNA的起始池，由不同的线型示意性表示。 (B) 左图描述了在RNA 5’ 端连接之前的不同酶预处理，以富集不同的RNA亚型。在各自的5’ 端预处理后可用于接头连接的RNA类别在每个预处理下示意性表示。右图描述了可用于3’ 端(-oligo(A)或-oligo(C)尾)和接头连接的RNA类别的亚型。 (C)与RNA 5’(左)和3’(右)末端修饰以及cDNA构建的后续步骤相关的可能偏差
·采用TPM衡量small RNA表达水平的潜在问题
在small RNA测序分析中，不同的实验条件或不同研究的数据集中，small RNA整体表达水平变化很大，这导致使用TPM值衡量small RNA在样本间的表达差异存在偏差[3-4]。如图2[5]所示，在其它RNA的绝对丰度没有变化的情况下，一个RNA的绝对丰度变化，就会使得其它所有RNA的TPM值成比例变化。TPM值完全依赖于样本中的RNA组成，且少数高表达的基因表达变化就可以影响整体TPM定量的准确性。
圖2 .miRNA测序的TPM值堆积图。除了*代表的RNA，其它所有miRNA在Baseline和Experiment条件下表达不变。然而，*代表的RNA丰度在Experiment条件下上升至2倍时，会同时导致其它所有miRNA的TPM值相应下降，即使这些miRNA的绝对表达水平没有变化[5]
·样本要求量高
對於tRNA和tsRNA测序，在文库构建之前，目标RNA的分离和预处理需要5 ug甚至更多的总RNA 量[6]，这使得样品量有限的研究项目更加难以进行。
多種Small RNA同时准确定量的解决方案
Arraystar small RNA芯片结合直接末端标记和巧妙的探针设计微阵列技术，有效弥补了small RNA测序的各项短板，在一张芯片上可同时检测和量化包括miRNA、pre-miRNA、tsRNA、tRNA和snoRNA在内的小RNA，为研究疾病中small RNA的调控功能和挖掘生物标志物潜力提供重要的表达信息。与small RNA测序相比，该芯片具有以下优势：
• 提高Small RNA表达谱的门槛，达到高灵敏度、特异性和准确性。实验流程简单直接，克服了small RNA-seq中由于RNA修饰、RNA二级结构、反转录阻碍、PCR扩增和数据分析不准确造成的偏差。
• 所需的RNA样本量低至100ng，为许多研究创造了机会。
• 可以检测低质量RNA样本，如降解的RNA、血清/血浆等体液RNA、FFPE RNA。
參考文獻：
[1] Kapranov, P., et al. (2012) Methods Mol Biol [PMID: 22144202]
[2] Dabney, J. and Meyer, M. (2012) Biotechniques [PMID: 22313406]
[3] Zhao, Y., et al. (2021) J Transl Med [PMID: 34158060]
[4] Zhao, S., et al. (2020) RNA [PMID: 32284352]
[5] Witwer, K. W. and Halushka, M. K. (2016) RNA Biol [PMID: 27645402]
[6] Shi, J., et al. (2021) Nat Cell Biol [PMID: 33927371]
