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HyPro-seq/芯片

簡介
技術原理
實驗流程
技術優勢
應用方向
Hypro-DNAseq 结果
Hypro-RNAseq /芯片结果

生物分子凝聚體（biomolecular condensate）是细胞内广泛存在的一种微米级别的特殊结构，是近几年来生命科学领域的一个新兴热点，大部分生物功能的正常执行都依赖于它的产生。它是由特定的RNA /DNA/蛋白分子通过液-液相分离（Liquid-liquid phase separation）的过程组装形成的液滴，例如miRNA、tsRNA与AGO蛋白形成的P小体，m6A mRNA、tsRNA与其互作蛋白形成的压力应激颗粒等。

與常見的RNA-蛋白/蛋白-蛋白等复合物不同，生物分子凝聚体内是通过多价弱相互作用进行结合的，并且涉及的时序和空间尺度更大，调控的生物学过程也更复杂，包括影响基因表达调控[1]、高级染色质结构[2]、免疫信号通路激活等[3]，并与多种人类疾病如神经退行性疾病和癌症有因果关系。通过形成生物分子凝聚体，这些时空依赖性的生命活动能够将行使特定功能所需的各种RNA /DNA/蛋白聚集在小范围区域中，在没有整体基因表达水平变化的情况下提高参与生物学过程的RNA/DNA/蛋白丰度，从而有效促进其发挥相应功能。

圖1. 液-液相分離形成的生物分子凝聚體種類[4]。

作爲與疾病密切相關的新興研究領域，在pubmed中检索生物分子凝聚体相关文献，数据呈现逐年递增的状态，其中不乏CNS级别的重磅文章。目前也有多家药企在针对生物分子凝聚体进行相应的疾病药物研发工作，我们有理由相信这个领域将迎来爆发式的增长。
HyPro靶RNA临近标记（Hybridization-proximity labeling）是一种空间相互作用组学研究技术，为研究生物分子凝聚体的组成提供了有力的支持[5]。传统的方法难以研究空间层次上的相互作用以及多价弱相互作用，而HyPro靶RNA邻近标记技术依赖于具有标记功能的酶—过氧化氢酶APEX2，可以在活细胞水平对邻近生物分子进行生物素标记。

參考文獻：
[1] Jessica Sheu-Gruttadauriaet et al. Cell. 2018. PMID: 29576456
[2] Arnold PR, Wells AD, Li XC. Front Cell Dev Biol. 2020.PMID: 31993419
[3] Chen Shen et al. Cell. 2021. PMID: 34678144
[4] Banani SF, et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017. PMID: 28225081
[5] Yap, Karen et al. Mol Cell. 2022. PMID: 34741808
HyPro酶是由APEX2和DIG结合蛋白以一段较短的linker连接在一起，共同组成的活性融合蛋白。其中DIG结合蛋白用于结合带有DIG修饰的DNA探针，而DIG-DNA探针是根据靶标RNA设计的一条或者多条互补的DNA序列；而APEX2在一定空间范围内游离，类似鱼竿拉扯的钩饵，在H2O2的催化下，能将生物素活化，共价连接到临近的RNA和蛋白上，因此该技术能够特异性识别目的RNA并通过生物素标记临近区域的RNA和蛋白，这些生物素化的RNA和蛋白可以被链霉亲和素偶联的磁珠富集，之后可以通过测序和质谱进行分析鉴定。

图2. HyPro靶RNA临近标记技术原理图。地高辛标记探针与靶RNA结合，HyPro酶一端结合地高辛标记探针，一端活化biotin标记目标RNA空间临近的蛋白质、RNA，而后利用链霉亲和素磁珠捕获biotin标记的蛋白和RNA进行质谱和测序检测
图3. HyPro实验流程图
1. 既適用於強相互作用，也适用于弱相互作用以及瞬時相互作用；

2. 在细胞内原位进行标记，反映细胞内真实状态，可以同时标记RNA和蛋白,可用来研究RNA-蛋白复合体的功能；

3. 具有信号放大的效果，灵敏高；快速反應，在1min中之内完成标记，特異性高；标记范围为20nm，用来研究靶向RNA的空间互作关系；

4. 几乎适用于所有的细胞类型和组织，实验使用的是APEX2的融合蛋白，与过表达APEX2的技术相比，適用於難以轉染的細胞類型（例如干细胞、神经细胞）、非模式生物样本和临床样本；

5. 融合蛋白的使用能够降低标记背景，降低细胞毒性以及错误定位概率；
6. 樣本量少，細胞用量4*10^7个细胞；组织300mg
1. 靶向miRNA/mRNA/LncRNA/CircRNA/tsRNA的空间互作蛋白、RNA、DNA；
Arraystar lncRNA芯片技术服务
 Arraystar circRNA芯片技术服务
 Arraystar smallRNA芯片技术服务
 tsRNA测序技术服务
 轉錄組測序技術服務

2. 探究RNA-蛋白复合体在液-液相分离形成condensate过程中的动态变化和功能；
3. 研究由多种enhancer RNA/SE-lncRNA和蛋白组成的超级增强子的结构和功能；
Arraystar SE-lncRNA芯片技术服务
ChIP-seq技术服务

4. 探究m6A mRNA结合reader影响生物分子凝聚体形成及功能(转录/剪切/稳定性/翻译)；
Arraystar mRNA&lncRNA表观转录组芯片
RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq）
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HyPro-seq/芯片

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