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單細胞測序技術服務 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 單細胞全轉錄組測序 |
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生物分子凝聚體研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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RNA-蛋白相互作用 HyPro - MS CHIRP – MS RNA pull-down MS |
RNA-RNA/DNA相互作用 HyPro-seq/芯片 CHIRP-seq |
蛋白-RNA相互作用 AGO APP seq/芯片 RIP-RNA seq/芯片 |
蛋白-蛋白相互作用 RIME MS CoIP-MS |
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NGS测序技术服务 R-loop 测序分析服务 |
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NGS测序技术服务 環狀DNA测序 |
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基因芯片技術服務 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 表觀轉錄組學測序服務 RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 MeRIP-PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）技术服务 |
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Ribo-seq Ribo seq |
核糖體-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC联合mRNA-seq |
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蛋白表達定量 Label free非标定量技术 TMT标记定量技术 PRM靶向定量 |
尽管全球范围内胃癌（GC）的发病率和死亡率呈下降趋势，但GC仍然是中國癌症相關死亡的第三大原因。近几十年见证了胃癌治疗的巨大进步，包括内镜切除、靶向治疗和免疫治疗 。但是，由于肿瘤的侵袭和转移，晚期患者的预后仍然很差。因此，了解肿瘤发生的分子机制对于胃癌的早期诊断和治疗具有重要意义。
M6A是真核生物RNA常見的化學修飾，m6A介導的ncRNA修飾與癌症有關。Mettl14是m6A的修飾酶複合物組分，而Mettl14介導的ncRNA m6A修飾與胃癌及的關係有待進一步研究。此次研究探索了Mettl14介導的m6A修飾的circORC5在胃癌進展中的功能機制，研究成果于2022年2月發表在國際著名學術期刊《Molecular Cancer》（IF: 27.0401）上。（m6A-circRNA表觀轉錄組芯片由给我免费播放片高清在线观看生物丨数谱生物提供技術服務）。
預實驗
为了研究 Mettl14 在胃癌中的潛在作用，首先分析了来自TCGA的RNA-seq數據和免疫組織芯片的Mettl14的表達，结果显示人类胃癌组织样本中Mettl14的表達相對於正常組織降低，其低表达是胃癌患者生存率低的预后因素。
高通量篩選
为了研究METTL14下游的靶基因，作者在胃癌细胞中敲低了Mettl14，通过Arrraystar Human m6A-circRNA表觀轉錄組芯片篩選到898個circRNA具有m6A水平改變（FC>2, P<0.05）。MeRIP-qPCR及qPCR實驗證實Mettl14的沉默降低了circORC5 m6A水平，但增加 circORC5 表達。因此将circORC5 鑑定爲 Mettl14的下游靶標。
功能研究
Mettl14的過表達顯著抑制了胃癌的生長和侵襲，而Mettl14的敲低則促進胃癌細胞的增殖和侵襲，敲低Mettl14的同時敲低circORC5，胃癌细胞的增殖和侵袭重新被抑制，说明circORC5受Mettl14調控。
機制研究
通过生信预测，circORC5可以結合miR-30c-2-3p。通过Ago-RIP-qPCR實驗發現Ago蛋白結合circORC5 與miR-30c-2-3p。双荧光素酶报告基因实验证实circORC5可以結合miR-30c-2-3p。敲除circORC5促進miR-30c-2-3p表達，导致其靶基因AKT1S1 和 EIF4B 下調。敲除circORC5同時敲除Mettl14抑制miR-30c-2-3p 上調，说明Mettl14是circORC5上游的負調控因素。
結論
Mettl14上調circORC5的m6A修飾水平進而抑制circORC5表達，进而导致miR-30c-2-3p上調及其靶基因AKT1S1 和 EIF4B 下調最終影響胃癌進展。
技術路線
結果展示
图1. 預實驗發現Mettl14與胃癌相關。左上：TCGA數據庫分析Mettl14在胃癌中顯著降低。右上：KM生存曲線分析Mettl14降低，胃癌的生存期显著下降。左下：敲低Mettl14顯著促進胃癌細胞MGC803的增殖。右下：胃癌细胞过表达Mettl14的裸鼠成瘤實驗證實敲低Mettl14顯著抑制胃癌的體積。
图2. Arrraystar Human m6A-circRNA epitranscriptomic芯片篩選到circORC5
左：通过Arrraystar Human m6A-circRNA epitranscriptomic芯片篩選差異m6a修飾的circRNA結果聚類圖。中：MeRIP-qPCR結果顯示circrna的m6A甲基化水平顯著降低。右：qPCR顯示敲低Mettl14發現circORC5在胃癌中表達水平顯著升高。
图3. 左上：circORC5和 miR-30c-2-3p 之間潛在結合位點的示意圖。右上：用 miR-30c-2-3p 模擬物轉染 MGC-803 和 AGS 細胞後 WT luc-circORC5 或 Mut luc-circORC5 的熒光素酶活性。左下：Ago2-RIP-qPCR 用於檢測 circORC5 和 miR-30c-2-3p 在 MGC-803 細胞中的可以結合。右下：用 si-METTL14 和（或）si-circORC5 轉染對 MGC-803 和 AGS 細胞中 AKT1S1 和 EIF4B 表達影響的蛋白質印跡分析。
图4. 胃癌中 METTL14 的研究思路示意圖。METTL14 增加 circORC5 的 m6A水平並抑制 circORC5表達，从而上调 miR-30c-2-3p 並下調其靶基因AKT1S1和EIF4AB，有助于抑制胃癌的发生发展
文章鏈接:
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-022-01521-z
