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單細胞測序技術服務 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 單細胞全轉錄組測序 |
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生物分子凝聚體研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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RNA-蛋白相互作用 HyPro - MS CHIRP – MS RNA pull-down MS |
RNA-RNA/DNA相互作用 HyPro-seq/芯片 CHIRP-seq |
蛋白-RNA相互作用 AGO APP seq/芯片 RIP-RNA seq/芯片 |
蛋白-蛋白相互作用 RIME MS CoIP-MS |
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NGS测序技术服务 R-loop 测序分析服务 |
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NGS测序技术服务 環狀DNA测序 |
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基因芯片技術服務 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
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LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
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Ribo-seq Ribo seq |
核糖體-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC联合mRNA-seq |
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蛋白表達定量 Label free非标定量技术 TMT标记定量技术 PRM靶向定量 |
中山大學生命科學學院陳月琴教授和王文濤副教授作爲共同通訊，在Cell Report發表名爲“Chromatin-associated orphan snoRNA regulates DNA damage-mediated differentiation via a noncanonical complex”的研究性论文，该文章採用Arraystar snoRNA PCR芯片篩選發現急性髓系白血病AML細胞中染色質相關孤兒snoRNA(casnoRNA) SNORA73在多柔比星處理AML細胞導致DNA損傷壓力時表達下調；功能研究发现SNORA73的下調可以維持基因組穩定性並抑制造血系統惡性腫瘤分化。机制研究发现，SNORA73的5’端非經典結構可以結合PARP1，通過與PARP1及H/ACA結合蛋白DKC1/NHP2形成SNORNP複合物來抑制PARP1的多聚ADP-核糖基化修飾PARylation(簡稱PAR修飾)，进而影响癌基因组稳定性及腫瘤細胞分化。該研究成果於2022年發表在學術期刊Cell Report上，影響因子爲9.423（snoRNA PCR芯片由给我免费播放片高清在线观看生物|數譜生物提供技術服務）。
研究背景
小核仁RNA（snoRNA）主要定位于细胞核的核仁，根据结构的区别可以分为C/D box與H/ACA box兩種不同類型。它們具有保守的序列特徵，可以与小核仁核蛋白形成snoRNP複合物，进而为rRNA添加修飾，促进核糖体功能的正常运转。然而，有很大一部分 snoRNA（称为孤儿 snoRNA）缺乏rRNA修飾靶點且功能未知。孤兒 snoRNA 不與核仁中的 rRNA 配對，它们可能具有不同的亞細胞定位模式和非經典功能。
越來越多的研究揭示snoRNA在各種惡性腫瘤中異常表達，可调控癌症进程。其中一項泛癌研究表明，有76種snoRNA具有臨牀相關性。且在造血过程中，一部分snoRNA的表達具有發育和譜系特異性。此外，在包括以分化阻滞为特征的急性髓系白血病 (AML) 在內的造血系統惡性腫瘤中也觀察到特定 snoRNA 的下調。由於snoRNA介導rRNA修飾並促進翻譯的經典功能，对癌细胞的高增殖率至关重要，因此snoRNA的下調不太可能通過發揮其經典功能而促進癌症發展，snoRNA很可能在腫瘤轉化過程具有非經典的新功能。
研究思路
snoRNA高通量篩選
Doxorubicin多柔比星處理可誘發DNA損傷壓力，文章分離了多柔比星處理前後AML NB4細胞的細胞核質和染色質相關組分，分别进行Arraystar snoRNA PCR芯片篩選，根据差异倍数>2，P值<0.05發現203個snoRNA在染色質組分富集，命名为染色质相关snoRNA(casnoRNA)，其中56個casnoRNA沒有預測到rRNA靶點，属于孤儿casnoRNA。通过比较多柔比星处理前后的孤儿casnoRNA，发现SNORA73下調且在細胞和臨牀樣本中qPCR驗證趨勢相符。
In vitro功能研究發現，SNORA73敲低可抑制DNA損傷及ATRA誘導的AML細胞分化並恢復癌細胞的克隆形成能力。In vivo功能研究發現，SNORA73敲低增加了小鼠骨髓、外周血、肝和脾脏的白血病细胞浸润并抑制了骨髓和外周血的白血病细胞分化。
機制研究發現，SNORA73 5’端形成非經典H/ACA box結構，tRSA pulldown和RIP實驗證明SNORA73 5’端非經典結構可以結合PARP1蛋白。PARP1 是一種 ADP-核糖聚合酶，可催化多聚ADP-核糖基化，既可以修飾自身，也可以修饰其他蛋白質。 PARP1 自身 PAR修飾對於誘導 DNA 損傷應激後啓動 DNA 損傷修復至關重要。FLAG-PARP1 CO-IP等實驗證明PARP1通過SNORA 73結合DKC1/NHP2抑制自身PAR修飾，进而影响癌基因組穩定性和DNA損傷介導的分化。
技術路線
結果展示
圖1： snoRNA芯片顯示染色質相關組分中SNORA73富集且在多柔比星处理后下调。
A Arraystar snoRNA PCR芯片熱圖顯示AML細胞NB4染色質相關組分CA中部分casnoRNA富集；
B 多柔比星處理前後火山圖顯示上下調casnoRNA；
C 臨牀樣本qPCR驗證SNORA73在AML病人中顯著下調。
圖2：In vitro和in vivo功能研究發現，SNORA73敲低可以維持基因組穩定性並抑制AML分化。
A In vitro SNORA73敲低可抑制DNA損傷（γ-H2AX：DNA損傷marker）；
B In vitro SNORA73敲低可抑制ATRA誘導的AML細胞分化；
C In vivo SNORA73敲低可抑制小鼠骨髓和外周血中白血病细胞的分化能力；
D In vivo SNORA73敲低增加了小鼠骨髓、外周血、肝和脾脏的白血病细胞浸润。
圖3：機制研究證實SNORA73 5’ 端非經典結構可以結合PARP1。
A與經典H/ACA box SNORA53相比，SNORA73 5’端具有非经典结构；
B tRSA pulldown-MS及WB驗證發現，SNORA73 5’端非經典結構可以結合PARP1；
C PARP1 RIP-PCR反向證明PARP1結合SNORA73。
圖4：机制研究證實PARP1及H/ACA結合蛋白DKC1/NHP2形成複合物來抑制PARP1的PAR修飾。
A Flag-PARP1 Co-IP實驗證明PARP1可以結合DKC1/NHP2；
B Flag-PARP1-IP WB實驗證明PARP1結合DKC1/NHP2抑制自身PAR修飾；
圖5：作用機制圖，在DNA損傷壓力下SNORA73从染色质释放，通过与PARP1及H/ACA結合蛋白DKC1/NHP2形成SNORNP複合物來抑制PARP1自身的PAR修飾，进而影响癌基因组稳定性和DNA損傷介導的分化。
研究意義
本研究使用Arraystar snoRNA PCR芯片篩選發現多柔比星處理誘導的DNA損傷壓力下，染色质相关的孤儿snoRNA SNORA73表達下調，且在AML病人中表達下調。功能研究發現SNORA73的下調可以維持基因組穩定性並抑制AML細胞分化。机制研究发现，SNORA73 通過與PARP1及DKC1/NHP2形成非經典複合物來抑制PARP1自身的PAR修飾，进而影响癌基因组稳定性及肿瘤细胞分化。這項工作揭示了孤兒casnoRNA的作用，并强调了snoRNA非經典結構與其功能多樣性的聯繫，为snoRNA研究提供了新的思路與方法。
原文出處
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Arraystar nrStar™ snoRNA PCR芯片
snoRNA RT-qPCR
RIP-PCR
