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單細胞測序助力腫瘤異質性研究新思路

單細胞測序助力腫瘤異質性研究新思路

腫瘤組織樣本中的細胞類型異質性（ITH）

腫瘤組織不僅由腫瘤細胞組成，还包括基质细胞（成纤维细胞和内皮细胞）和免疫细胞，如T細胞，NK細胞B細胞，树突状细胞和巨噬细胞[1]。为了获得肿瘤细胞特异性RNA表达水平，我们应该将肿瘤细胞与基质细胞和免疫细胞分开。
單細胞測序(scRNA-seq)通過tSNE圖聚類分析將腫瘤細胞與其他基質和免疫細胞分離並特異性定量腫瘤細胞RNA表达水平，同時，通过基因集变异分析（GSVA）獲得腫瘤細胞特異性激活的通路，被证明是一种強大的檢測工具。

圖1. scRNA-seq通过t-SNE圖鑑定並區分腫瘤細胞與其他基質和免疫細胞[1]

區分不同細胞亞羣后，scRNA-seq可提供腫瘤細胞特異性差異表達分析，以确定腫瘤細胞在疾病治療或進展等過程中是否具有基因表達的差異。

圖2. scRNA-seq火山图展示肿瘤特异性差异表达基因 [1]

通過GSVA分析恶性與非惡性上皮細胞比較中顯著富集的通路。

圖3. 使用GSVA分析對腫瘤細胞和正常上皮細胞（3873个肿瘤细胞與4201個正常上皮細胞）中每個細胞的通路活躍度差異進行評分。T 值來自線性模型，校正了不同患者來源的影響[2]。

腫瘤細胞異質性

與不同細胞正常分化導致的細胞間異質性相比，不同腫瘤細胞即使處在相似的不同分化階段，同样也顯示出更大的細胞間異質性。這種增加的細胞間差異很可能是由於腫瘤內部自身的基因組異質性導致的，或者是由于不正常/异质化的肿瘤微环境（相比于正常组织环境）提供给细胞的信号异质性导致的。除了由于基因组序列多样性以及肿瘤微环境异质性导致细胞差异之外，这些细胞间的差异也可能是由于整体表观基因组的变化造成的，这一现象已经在肿瘤细胞中被普遍报道[3]。（例如广泛的CpG岛低甲基化）。腫瘤細胞表型的多樣性可能對腫瘤的侵襲和轉移、對不同治療方案的響應、整體疾病的進展有重要影響。例如，在頭頸部癌症中，也使用scRNA-seq鉴定了EMT狀態的差異，其中不同的EMT狀態與侵襲和轉移擴散相關[4]。

圖4. 黑色素瘤細胞表型可塑性。黑色素瘤中，不同轉錄狀態或表型的細胞能夠在同一個腫瘤組織中共存，進而使腫瘤整體上能夠在高MITF表達狀態（色素型）与高AXL表達狀態（侵襲型）之间切换。与增殖相关的高MITF表達特徵驅動初始腫瘤生長，然後腫瘤整體能夠切換到侵襲性的高AXL表達狀態，使其能夠進一步侵襲和擴散。而在到達轉移部位後又必須切換回增殖表型以促進生長。小眼畸形相關轉錄因子（MITF）高表達腫瘤對MAP-激酶抑制剂（MAPKi）治疗有反應，因爲BRAF介导的增殖和生存依赖于MITF [5]。

scRNA-seq方法已被證明是一種強大的工具，通過t-SNE圖sub-cluster亞羣分析區分癌細胞亞型並特異性定量特定癌症亞型的RNA表达水平。

圖5. 三種形態學上同質的腫瘤細胞亞羣中，某个特定的RNA转录本在不同细胞亚型间表现出不同的表达模式，顏色較深表示該RNA表达水平较高。常規的bulk RNA测序只能检测RNA在整体细胞亚群中的平均表達值，无法区分不同的细胞亚型。相比之下，单细胞測序可以輕鬆地區分細胞亞型中的RNA是均質表達（左）、整体差异表达（中）还是具有稀有高表達（右）[6]。

腫瘤微環境（TME）中的细胞异质性

TME主要分为免疫和基质細胞成分，这两者都可以使用scRNA-seq方法鑑定分析。在基质細胞類型中，成纤维细胞一直是一种令人感興趣的細胞類型，因为它们经常被重编程为癌相关成纤维细胞（CAFs）。在多種癌症中，scRNA研究揭示了在基質構建，血管生成和免疫调节方面具有不同功能的异质CAF亚型。另一种研究較多的基質細胞類型是內皮細胞，它可以被重编程为肿瘤内皮细胞（TECs），通过調節血管形成和調控免疫細胞來促進腫瘤進展。scRNA-seq方法可以解析内皮细胞的亚型，并揭示可以靶向的信號通路。由於免疫療法在癌症治療中越來越多的應用，TME中的免疫細胞目前是實體瘤中另一個熱門研究領域。利用scRNA-seq来分析T細胞的多項研究表明，免疫抑制性微环境与预后不良有關，其中耗竭型T细胞的增加和激活型T细胞的減少與各種癌症的進展密切相關。此外，scRNA-seq揭示了組織駐留記憶T细胞在乳腺癌中具有更高的細胞毒性活性，并且与三阴性乳腺癌（TNBC）患者的良好预后相关。髓系細胞是TME的另一个组成部分，与几种癌症类型的患者预后有关。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）传统上被归类为M1（促炎）或M2（促癌）型，然而scRNA-seq数据表明，存在连续的巨噬细胞表达程序，TAMs具有多種細胞狀態，从而对这种简单的分类提出了挑战[1]。 scRNA-seq方法已被证明是描绘TME和鑑定腫瘤中重編程的免疫和基質細胞類型的強大工具，这些细胞类型可以促进或抑制肿瘤生长或与治疗抵抗有关。这些数据原则上可用于在临床环境中单独选择针对异常细胞类型的靶向療法。

腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）控制肿瘤细胞表型
CAFs是一系列分泌蛋白的來源，例如转化生长因子β（TGF β）或细胞外基质（ECM）蛋白，这些蛋白可以诱导肿瘤具有MITF低表達同時AXL高表達的侵襲表型。此外，衰老成纖維細胞的分泌組中一些額外的與細胞衰老相關的蛋白，如sFRP2，有助于MITF下調和誘導去分化的AXL高表达表型。

圖6. 腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）控制黑色素瘤細胞表型[5]

圖7. 肺癌與非惡性肺組織中1465个成纤维细胞的t-SNE图，图上的颜色表示了不同的成纖維細胞亞羣（上图）或样品来源类型（下图）。虽然成纤维细胞总体上仅在肿瘤中部分富集，但类群1在肿瘤中强烈富集（肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）），类群6在非恶性样品中富集[2]。

圖8. T-SNE 图，圖上顏色代表成纖維細胞不同細胞亞羣的標記基因表達量（灰色至红色表达量逐渐升高）[2]。

圖9. GSVA通过單細胞層面分析得到不同成纖維細胞類羣之間的通路活性差異。展示的是來自線性模型的 t 值，已针对患者来源进行了校正。類羣2显示出与肌生成过程相关基因（例如，MEF2C，MYH11或ITGA7），NOTCH信號通路基因和血管生成相關基因的高表達，表明这些细胞被強烈激活。虽然类群5和类群7高度相似，都具有较弱的肌生成過程和較高的mTOR特征表达，但它们在糖酵解基因的表达上存在差異，表明存在代謝差異。此外，类群1和类群4相似，但类群1顯示出強烈的上皮間充質轉換信號，表達大量的細胞外基質蛋白和TGF-β相关基因[2]。

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單細胞全轉錄組測序

參考文獻：
[1] Lim B, Lin Y, Navin N. Advancing Cancer Research and Medicine with Single-Cell Genomics. Cancer Cell. 2020
[2] Lambrechts D, Wauters E, Boeckx B, Aibar S, Nittner D, Burton O, Bassez A, Decaluwé H, Pircher A, Van den Eynde K, Weynand B, Verbeken E, De Leyn P, Liston A, Vansteenkiste J, Carmeliet P, Aerts S, Thienpont B. Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment. Nat Med. 2018
[3] Marusyk A, Janiszewska M, Polyak K. Intratumor Heterogeneity: The Rosetta Stone of Therapy Resistance. Cancer Cell. 2020.
[4]Puram SV, Tirosh I, Parikh AS, Patel AP, Yizhak K, Gillespie S, Rodman C, Luo CL, Mroz EA, Emerick KS, Deschler DG, Varvares MA, Mylvaganam R, Rozenblatt-Rosen O, Rocco JW, Faquin WC, Lin DT, Regev A, Bernstein BE. Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer. Cell. 2017.
[5] Arozarena I, Wellbrock C. Phenotype plasticity as enabler of melanoma progression and therapy resistance. Nat Rev Cancer. 2019
[6] Carter B, Zhao K. The epigenetic basis of cellular heterogeneity. Nat Rev Genet. 2021

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