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單細胞測序技術服務 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 單細胞全轉錄組測序 |
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生物分子凝聚體研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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RNA-蛋白相互作用 HyPro - MS CHIRP – MS RNA pull-down MS |
RNA-RNA/DNA相互作用 HyPro-seq/芯片 CHIRP-seq |
蛋白-RNA相互作用 AGO APP seq/芯片 RIP-RNA seq/芯片 |
蛋白-蛋白相互作用 RIME MS CoIP-MS |
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NGS测序技术服务 R-loop 测序分析服务 |
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NGS测序技术服务 環狀DNA测序 |
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基因芯片技術服務 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 表觀轉錄組學測序服務 RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 MeRIP-PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）技术服务 |
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Ribo-seq Ribo seq |
核糖體-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC联合mRNA-seq |
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蛋白表達定量 Label free非标定量技术 TMT标记定量技术 PRM靶向定量 |
意大利血液治療部門細胞再生醫學實驗室Lorenza Lazzari教授長期從事幹細胞特性與治療的相關研究。该课题组利用Arraystar circRNA芯片發現circFOXP1可維持間充質幹細胞（MSCs）的特性和分化能力。体内体外功能实验证实，敲低circFOXP1明顯抑制間充質幹細胞的分化。最后机制研究发现，circFOXP1與miR-17-3p/miR-127-5p相互作用，调控非经典Wnt與EGFR信號通路。对MSCs多能性進行重編程，发现circFOXP1與非經典Wnt信號通路下調，经典Wnt信號通路則顯著增強。意味着circFOXP1是幹細胞分子網絡中的重要分子。该研究成果发表在学术期刊Nucleic Acids Research上（IF:11.14）。(芯片實驗由Arraystar提供技術服務)
研究背景
人間充質幹細胞（MSCs）是能夠分化成多種類型細胞的多能性幹細胞，可以从成人或未出生婴儿的各种组织中分离得到，体外培养时，MSCs能夠進行自我更新或定向分化成中胚層組織細胞，比如骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞。因此MSCs被用來治療骨損傷等疾病，具有重要的临床应用价值。然而对于维持MSCs的特性背後的分子機制仍有待深入研究。
circRNA是一類將線性RNA分子的3’端和5’端通過共價連接形成的環形RNA分子，可以由外显子、内含子或者同时包含两种序列的片段组成。与线性分子相比，这种环形的结构可促进circRNA的穩定性。circRNA發揮功能的方式也有大量的研究，最主要的是一些circRNA分子可作爲miRNA的內源性競爭吸附海綿，间接调控细胞表型。
研究思路
文章着重於研究circFOXP1在間充質幹細胞的乾性維持過程中的功能與機制研究，运用Arraystar circRNA芯片檢測了成人造血幹細胞、脐带血干细胞与人皮肤成纤维细胞中差异表达的circRNA分子。通过p值≤0.05與差異倍數(FC值)≥1.5進行篩選後，挑选表达差异最显著的circRNA分子進行PCR驗證和一代測序，最终确定hsa_circ_0001320(circFOXP1)進行後續研究。
爲了研究circFOXP1在MSCs細胞中的功能，作者构建了circFOXP1的基因敲除細胞模型，发现间充干细胞的表面标志物在敲除circFOXP1後表達量明顯降低。敲低circFOXP1，可抑制MSCs向成骨細胞與脂肪細胞的分化。在大鼠股骨萎缩型骨不愈合模型中，敲低circFOXP1明顯降低大鼠骨癒合程度。
爲了研究circFOXP1在MSCs中發揮功能的作用機制，作者通过生信预测发现circFOXP1能夠吸附大量的miRNA分子，通过双荧光素酶实验发现过表达miR-17-3p、miR-127-5p、miR-370-3p能明顯抑制熒光素酶的表達。RNA pull down實驗發現在富集circFOXP1同時，也可以显著将miR-17-3p、miR-127-5p、miR-370-3p三個miRNA拉下來，证明circFOXP1可直接與miRNA相互作用。对这三个miRNA的靶基因進行GO分析後，发现其靶基因可显著富集到EGFR與非經典的Wnt信號通路中，最终调控MSCs的幹細胞特性維持。
技術路線：
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結果展示
圖1、Arraystar Human circRNA芯片高通量篩選結果及驗證。A 差異circRNA的聚類圖；B 挑選差異表達的13個circRNA 做qPCR驗證。
圖2、敲低circFOXP1調控MSCs幹細胞特性。A 核質分離檢測circFOXP1主要定位在細胞質中；B 敲低circFOXP1降低MSCs幹細胞特性細胞表面標誌物的表達；C 敲低circFOXP1，抑制MSCs向成骨細胞的分化；D 敲低circFOXP1，抑制MSCs向脂肪細胞的分化。
圖3、circFOXP1通過結合miRNA調控EGFR和非經典Wnt信號通路。A 雙熒光素酶實驗證實circFOXP1可結合miR-17-3p/miR-370-3p/miR-127-5p；B miR-17-3p/miR-370-3p/miR-127-5p靶基因GO富集分析。
圖4、circFOXP1調控MSCs細胞特性的機制模式圖。在间充质干细胞自我更新过程中，circFOXP1表達量上調，结合更多的miR12/miR127，抑制经典的Wnt信號通路；在分化过程中，circFOXP1表達量下調，miR17/miR127表達量上調，靶向WNT5A，激活非经典Wnt信號通路，促进MSCs幹細胞分化。
研究意義
本課題利用Arraystar circRNA芯片研究circFOXP1在間充質幹細胞特性維持過程中的功能與機制，证实了circFOXP1在MSCs細胞中具有重要作用。相比于分化的人皮肤成纤维细胞，造血干细胞、脐带血干细胞中circFOXP1顯著上調。在敲除circFOXP1的MSCs細胞中，干细胞特性相关的自我更新与分化能力都有极大程度的降低。生信分析与双荧光酶实验证实，circFOXP1可通過結合miR-17-3p/miR-127-5p間接調控EGFR與非經典的Wnt信號通路，维持MSCs細胞的乾性。
原文出處
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