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單細胞測序技術服務 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 單細胞全轉錄組測序 |
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生物分子凝聚體研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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RNA-蛋白相互作用 HyPro - MS CHIRP – MS RNA pull-down MS |
RNA-RNA/DNA相互作用 HyPro-seq/芯片 CHIRP-seq |
蛋白-RNA相互作用 AGO APP seq/芯片 RIP-RNA seq/芯片 |
蛋白-蛋白相互作用 RIME MS CoIP-MS |
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NGS测序技术服务 R-loop 测序分析服务 |
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NGS测序技术服务 環狀DNA测序 |
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基因芯片技術服務 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 表觀轉錄組學測序服務 RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 MeRIP-PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）技术服务 |
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Ribo-seq Ribo seq |
核糖體-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC联合mRNA-seq |
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蛋白表達定量 Label free非标定量技术 TMT标记定量技术 PRM靶向定量 |
近期，哈佛大學醫學院附屬布萊根婦女醫院Godlewski教授發表名爲“The nuclear DICER–circular RNA complex drives the deregulation of the glioblastoma cell microRNAome”的研究性論文。该论文应用Arraystar Human CircRNA芯片驗證了一個環狀RNA分子circ2082在膠質母細胞瘤中表達異常升高，而circ2082能夠通過DICER蛋白影響下游整體的基因表達情況進而促進腫瘤生長。該研究成果於2020年12月發表在國際著名學術期刊Science Advances (IF: 13.116)上。（芯片實驗由Arraystar提供技術服務）
研究背景
膠質母細胞瘤作爲一種常見的腦部惡性腫瘤，主要由星型膠質細胞癌變產生。由于该肿瘤具有浸润性高等特点，即使进行手术切除以及高度积极的治疗也难以避免肿瘤的复发。有临床数据表明，胶质母细胞瘤患者的生存期中位数仅为1年。因此，对于胶质母细胞瘤发生发展的机理研究对于相关疾病的治疗具有非常重要的价值。
環狀RNA（circRNA）是一类将线性RNA分子的3’端和5’端通過反向剪切共價連接形成的環狀RNA分子，可以由外显子、内含子或者同时包含这两种序列的片段组成。与线性分子相比，这种环形的结构可提高环状RNA的穩定性。环状RNA發揮功能的機制包括結合特定的蛋白來調控靶蛋白的功能，参与ceRNA調控機制等。
miRNA是一類長17-25nt的小非編碼RNA，主要功能包括与目的RNA結合從而抑制翻譯或導致其降解等。miRNA的加工成熟主要分爲兩步，从最初的pri-mRNA剪切形成pre-miRNA，进一步對pre-miRNA進行剪切最終形成成熟miRNA。在这一过程中，细胞质里的DICER參與了pre-miRNA的剪切，因而對於miRNA的成熟非常重要。
本次研究系統地探討了環狀RNA在膠質母細胞瘤發生發展中的作用，提出了環狀RNA通过結合蛋白來影響miRNA發揮功能的新機制，對於後續相關研究具有重要的借鑑意義。
技術路線
研究思路
TCGA數據庫數據分析
爲了研究影響膠質母細胞瘤發生發展的機制。作者采用TCGA數據庫數據進行分析，挑選了490例膠質母細胞瘤患者數據以及11例正常人數據進行比較，發現在膠質母細胞瘤患者中，整體miRNA的表達量偏低。此外，PCA分析發現，对比膠質母細胞瘤患者與正常人體內的miRNA表達譜，兩者間具有明顯差異。因此作者考虑是否胶质母细胞瘤患者癌细胞内miRNA加工成熟機制遭到破壞。
circ2082在細胞核內結合DICER
miRNA加工成熟包括了pri-miRNA在細胞核內剪切產生pre-miRNA，pre-miRNA出核之後在細胞質中的DICER作用下被剪切產生成熟的miRNA。作者通過核質分離後western blot檢測等實驗發現，在間充質型膠質母細胞瘤幹細胞以及前神經元型膠質母細胞瘤幹細胞中，DICER均存在顯著的細胞覈定位的現象，从而阻止其在细胞质中促进miRNA的成熟。随后，作者利用胶质母细胞瘤干细胞的细胞核与细胞质组分进行了IP等實驗，发现DICER在細胞核中與RBM3結合。更重要的是，通過使用DICER抗體，在膠質母細胞瘤幹細胞的細胞質組分中進行RIP實驗，將RNA產物進行測序，作者發現了能夠與DICER結合的環狀RNA分子，circ2082。
Arraystar Human CircRNA芯片驗證
爲了進一步研究膠質母細胞瘤幹細胞中環狀RNA分子的分佈情況，作者選取非惡性神經祖細胞(n=3)，间充质型胶质母细胞瘤干细胞(n=4)以及前神經元型膠質母細胞瘤幹細胞(n=4)進行Arraystar Human CircRNA芯片篩選以及q-PCR驗證。筛选结果表明circ2082在膠質母細胞瘤幹細胞內顯著上調，且在整體環狀RNA表達譜內排名前五，說明circ2082對於膠質母細胞瘤的發生發展具有非常重要的影響。
功能研究
爲了證明circ2082具有促癌效果，首先作者在细胞层面上进行幹細胞成球等實驗，結果表明敲低circ2082會導致膠質母細胞瘤幹細胞的增殖減弱。個體層面上，通過尾靜脈注射等實驗，作者發現在注射的膠質母細胞瘤幹細胞中敲低circ2082能夠顯著延長被注射小鼠的生存期。最后，作者利用TCGA數據庫中相關數據分析，通過KM曲線發現circ2082的下降能夠提高膠質母細胞瘤患者的生存時間。
機制研究
接下来，作者研究了circ2082發揮促癌功能的具體機制。首先，免疫荧光等实验表明，在膠質母細胞瘤幹細胞中敲低circ2082能夠導致DICER重新分佈在細胞質中，从而促進大部分miRNA（包括重要的抑癌miRNA，如miR-128、miR-124、miR-1等）的表達上調。除此之外，重要的促癌miRNA例如miR-21等則出現下調，表明circ2082除了能夠抑制整體miRNA的表達外，也可能存在其他促進腫瘤發生發展的機制有待深入研究。随后，作者采用Agilent Whole Human Genome芯片檢測了mRNA的表達變化情況，发现在基因层面上，circ2082發揮的促癌功能受不同細胞亞型的影響很大。
結果展示
圖1. 膠質母細胞瘤患者miRNA表達整體偏低
A：胶质母细胞瘤患者（n=490）與正常人（n=11）的成熟miRNA表达谱熱圖。細胞亞型：红色，间充质型；藍色，典型；绿色，前神经元型。535個miRNA表达數據來源於TCGA數據庫。
B：PCA分析能夠區分膠質母細胞瘤患者成熟miRNA组（红点，n=490）與正常人成熟miRNA組（蓝点，n=10）。
圖2. Circ2082在細胞核中結合DICER
A：Western blot檢測DICER在細胞質（C）和細胞核（N）中的分佈。NPC：非惡性神經祖細胞；M GSC：間充質型膠質母細胞瘤幹細胞；P GSC：前神經元型膠質母細胞瘤幹細胞。
B：在膠質母細胞瘤幹細胞細胞核組分中分別以IgG抗体以及DICER抗體進行RIP實驗，隨後q-PCR检测circ2082的含量。
C：使用同向引物與反向引物在cDNA或者基因組DNA中PCR驗證circ2082的环状特征。
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圖3. Arraystar Human CircRNA芯片驗證
A：差异环状RNA表達譜聚類圖。青色：非恶性神经祖细胞（n=3）；紅色：间充质型胶质母细胞瘤干细胞（n=4）；绿色：前神经元型胶质母细胞瘤干细胞（n=4）。
B：胶质母细胞瘤干细胞內差異環狀RNA火山圖。虚线爲篩選閾值，標識出的環狀RNA爲差異上調前五的環狀RNA。
C：Q-PCR验证胶质母细胞瘤中circ2082存在表達上調的現象。
圖4. Circ2082具有促癌效果
A：细胞成球實驗表明敲低circ2082能够抑制胶质母细胞瘤幹細胞的生長能力。
B：生存分析表明，尾靜脈注射敲低circ2082膠質母細胞瘤幹細胞的小鼠具有更長的生存期。
C：使用TCGA數據庫內的臨牀數據進行KM分析表明，circc2082表达較低的患者具有更高的生存期。
圖5. Circ2082影響DICER定位與相關基因表達
A：免疫荧光实验表明，在胶质母细胞瘤干细胞内敲低circ2082会導致DICER出核。
B：miRNA表達譜的聚類圖顯示，在间充质型胶质母细胞瘤干细胞（M GSC）與前神經型膠質母細胞瘤幹細胞（P GSC）內敲低circ2082会導致整體miRNA表達上升，且不同细胞亚型間差異不大。
C：q-PCR分析不同亚型腫瘤幹細胞敲低circ2082后相應miRNA的變化情況。
D：Agilent Whole Human Genome芯片分析敲低circ2082後對腫瘤幹細胞整體基因表達的影響。
研究總結
作者首先通過TCGA數據庫數據分析，發現膠質母細胞瘤患者體內miRNA表達整體偏低，據此將研究目標鎖定在對miRNA加工成熟具有重要功能的蛋白DICER上。通過前期核質分離WB檢測以及免疫熒光等實驗，作者發現在腫瘤細胞中DICER具有異常的細胞覈定位，據此通過RIP實驗發現DICER在細胞核中結合的環狀RNA分子circ2082。進一步，作者利用Arraystar Human CircRNA芯片對膠質母細胞瘤幹細胞中的差異環狀RNA進行篩選，結果表明circ2082在整體的環狀RNA表達譜上屬於上調前五的RNA分子。接下來，在功能研究部分，作者對circ2082進行敲低，發現其能夠影響腫瘤幹細胞的成球能力。此外，个体层面上的研究发现circ2082能夠影響小鼠的生存期以及臨牀患者的生存期，說明circ2082具有促癌的功能。機制上看，circ2082能夠影響DICER的細胞內定位，从而影响细胞整体的miRNA表達。同时，circ2082的敲低除了能夠解除抑癌miRNA的表達抑制之外，還能夠抑制促癌miRNA的表達。最後，作者發現，基因层面上circ2082發揮的促癌功能受不同細胞亞型的影響很大。总体而言，作者的研究思路清晰，数据详实，为胶质母细胞瘤的治疗提供了新的思路与方法。
文章鏈接：
https://advances.sciencemag.org/content/6/51/eabc0221
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给我免费播放片高清在线观看生物丨数谱生物可提供的相关技术服务 CircRNA 表達研究技術平臺: CircRNA表達譜檢測——Arraystar circRNA芯片： 針對CircRNA反向剪接位點設計特異性探針，准确检测circRNA，比测序更适合于circRNA表達譜分析。助力客户发表SCI文章超過350篇； 技術成熟，circRNA反向剪接位點設計引物，特异性检测目标circRNA。 circRNA與蛋白互作(circRNA ChIRP-MS) CircRNA可作爲蛋白海綿或者蛋白結合的骨架，影响蛋白功能。 circRNA ChIRP-MS通過用biotin標記的RNA anti-sense與已交聯的樣本進行雜交，并通过固定化avidin對biotin進行Pull-Down，得到RNA結合蛋白（RBP）并通过质谱鉴定目标circRNA結合的蛋白。
miRNA研究平臺
其他circRNA研究技術平臺： circRNA m6A檢測——Arraystar circRNA表觀轉錄組芯片：
檢測發生m6A修飾的circRNA；定量修饰百分比及修饰变化；total RNA要求量低至3ug。
circRNA m6A 甲基化PCR檢測： （1）验证或者检测某个m6A 修飾的circRNA：m6A抗體富集發生m6A修飾的circRNA + circRNA反向剪接位點設計引物保證m6A-circRNA的精確檢測 （2） 确定含有潜在m6ACA位點的circRNA是否真實發生m6A修飾：RNase R去線性RNA+ MazF酶處理 + m6ACA位點PCR檢測 。
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