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單細胞測序技術服務 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 單細胞全轉錄組測序 |
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生物分子凝聚體研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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RNA-蛋白相互作用 HyPro - MS CHIRP – MS RNA pull-down MS |
RNA-RNA/DNA相互作用 HyPro-seq/芯片 CHIRP-seq |
蛋白-RNA相互作用 AGO APP seq/芯片 RIP-RNA seq/芯片 |
蛋白-蛋白相互作用 RIME MS CoIP-MS |
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NGS测序技术服务 R-loop 测序分析服务 |
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NGS测序技术服务 環狀DNA测序 |
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基因芯片技術服務 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 表觀轉錄組學測序服務 RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 MeRIP-PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）技术服务 |
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Ribo-seq Ribo seq |
核糖體-新生肽链复合物(RNC) RNC联合 circRNA芯片 RNC联合 lncRNA芯片 RNC联合mRNA-seq |
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蛋白表達定量 Label free非标定量技术 TMT标记定量技术 PRM靶向定量 |
近期，復旦大學附屬中山醫院殷欣老師發表名爲“CircGPR137B/miR‑4739/FTO feedback loop suppresses tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma”的研究性論文。该论文应用Arraystar Human CircRNA芯片等技術發現了CircGPR137B能夠通過miR-4739調控m6A去修飾酶FTO的表達，而FTO又能反回來調控CircGPR137B本身的m6A修飾，从而形成正反馈的通路，进一步下调CircGPR137B與FTO的表達，从而抑制肝細胞癌的生長。該研究成果於2022年7月發表在國際著名學術期刊《Molecular Cancer》 (IF: 41.44)上。（circRNA芯片由给我免费播放片高清在线观看|數譜生物提供技術服務）
研究背景
肝细胞癌是全球第六大癌症，已知乙肝病毒感染，黄曲霉素的摄入等多种因素均能促进肝细胞癌的发生。对于肝细胞癌的治疗，除了常规的手术切除以及放化疗之外，最新的治疗手段包括靶向药物治疗等均具有较好的效果。然而，为了实现根治肿瘤的目的，仍需开发新的治疗方法。因此，对于影响肝细胞癌发生发展的机制研究依然具有重要的意义。
環狀RNA（circRNA）是一类将线性RNA分子的3’端和5’端通過反向剪切共價連接形成的環狀RNA分子，可以由外显子、内含子或者同时包含这两种序列的片段组成。与线性分子相比，这种环形的结构可提高环状RNA的穩定性。环状RNA發揮功能的機制包括結合特定的蛋白來調控靶蛋白的功能，参与ceRNA調控機制等。
m6A修飾是目前研究最多的一類RNA修飾分子。這一修飾的特徵是在核糖核苷酸的A鹼基上添加一個甲基基團，进而影响对应RNA分子的功能。已知和m6A修飾相關的蛋白主要可以分爲三類，首先，writer蛋白負責將修飾添加到RNA分子上，這類蛋白包括mettl3、RBM15等。其次，eraser蛋白負責將修飾從RNA分子上去除，主要包括ALKBH5、FTO等蛋白。最後，reader蛋白能夠識別RNA分子上的m6A修飾，進一步與該分子結合後發揮相應的調控功能，例如IGF2BP家族蛋白使得RNA分子更加穩定，YHTDF1促進mRNA翻譯等等。
本次研究系統地探討了環狀RNA在肝細胞癌中的作用，提出了環狀RNA通过ceRNA機制來影響細胞m6A修飾，形成正反馈通路促进肝细胞癌发生发展的新机制，對於後續相關研究具有重要的借鑑意義。
研究思路
Arraystar Human CircRNA芯片篩選
爲了研究肝細胞癌（HCC）發生發展的相關機制，作者对HCC患者腫瘤組織利用Arraystar human circRNA芯片進行高通量篩選。结果发现，与癌旁组织相比，在HCC患者的腫瘤組織中，CircGPR137B出現了顯著的下調。进一步在临床样本上的PCR驗證也證實了這一現象的存在。利用RNase R處理後PCR結果表明，CircGPR137B的表達並未出現明顯的下降，因而说明其确实存在环形的特征。最后，KM曲線分析表明CircGPR137B低表達的腫瘤預後較差。
功能研究
爲了確定CircGPR137B的功能，作者在HCC細胞系中過表達/敲低了CircGPR137B，结果发现CircGPR137B能夠抑制腫瘤細胞生長。随后，作者在小鼠体内也进行了类似研究，发现在体内，CircGPR137B依舊能夠抑制腫瘤的生長以及轉移，表明CircGPR137B具有顯著的抑癌功能。
機制研究
首先，利用AGO-RIP以及雙熒光素酶等實驗，作者发现CircGPR137B能夠結合miR-4739，进而调控m6A去甲基化酶FTO的mRNA水平變化。因此在肿瘤细胞，FTO的mRNA表達與CircGPR137B一樣都呈現下調的趨勢。进一步的，作者利用RIP-PCR發現，FTO蛋白能夠直接與CircGPR137B結合。通过MeRIP-PCR等實驗，作者发现FTO蛋白水平的下降能夠增加CircGPR137B的m6A修飾水平，进而导致CircGPR137B的穩定性下降。因此，肿瘤细胞中CircGPR137B的表達水平下降能夠通過下調FTO的表達，增加CircGPR137B本身的m6A修飾水平，进一步促进CircGPR137B以及FTO的表達量下調，从而形成一条促进HCC發生發展的正反饋通路。
技術路線
結果展示
圖1. Arraystar Human CircRNA芯片篩選到CircGPR137B
A：聚类图展示差異circRNA的表達情況，發現CircGPR137B在HCC（肝細胞癌）中表達下調。
B：火山图展示差異circRNA的分佈情況。
C：Q-PCR验证發現HCC中CircGPR137B表达下調。
D：RNase R处理後進行q-PCR检测，发现CircGPR137B表达量未出現明顯下降。
E：K-M曲線分析發現，CircGPR137B低表达的腫瘤預後較差。
圖2. CircGPR137B抑制腫瘤生長
A：MTT實驗表明過表達CircGPR137B抑制腫瘤細胞增殖。
B：細胞遷移實驗發現，過表達CircGPR137B抑制肿瘤細胞遷移。
C：小鼠成瘤實驗發現，过表达CircGPR137B抑制體內腫瘤組織生長。
圖3. CircGPR137B作用機制研究
A：AGO-RIP實驗發現，CircGPR137B與miR-4739均能結合ago2，表明circRNA能夠靶向對應的miRNA發揮功能。
B：双荧光素酶實驗表明，miR-4739能够直接與FTO的mRNA 3’ UTR结合，发挥调控功能。
C：RIP實驗表明，FTO蛋白能夠直接與CircGPR137B结合。
D：MeRIP-PCR实验表明，FTO蛋白能夠調控CircGPR137B上的m6A修饰水平。
E：敲低FTO後，CircGPR137B表达水平下降，從而形成正反饋通路調節腫瘤生長。
F：敲低CircGPR137B或者FTO均能抑制腫瘤細胞轉移。
圖4. CircGPR137B作用機制模型
腫瘤細胞中CircGPR137B的表達水平下降能夠通過ceRNA機制影響miR-4739，進而下調FTO的表達，增加CircGPR137B本身的m6A修飾水平。这一结果會進一步促進CircGPR137B與FTO的表達量下調，从而形成一条促进HCC發生發展的正反饋通路。
研究意義
作者首先通過Arraystar Human CircRNA芯片進行篩選，利用HCC（肝細胞癌）患者组织与癌旁组织进行比较，篩選到了與HCC發生發展相關的重要環狀RNA分子CircGPR137B。进一步通过细胞层面敲低以及过表达等功能实验发现，CircGPR137B能够抑制细胞增殖与迁移，小鼠层面的体内研究也获得了相同的结论。此外，作者发现CircGPR137B能夠結合miR-4739，通过ceRNA機制調控m6A去甲基化酶FTO的表達。有趣的是，FTO同時還能夠影響CircGPR137B的修飾水平。通过这一机制反过来调控CircGPR137B自身的表達水平，因而形成了一条正反馈通路，即肿瘤细胞中表达下降的CircGPR137B通過調控FTO的表達，倒回来使CircGPR137B自身的表達水平以及FTO的表達水平產生進一步的下調，从而影响HCC的發生發展。總體而言，这项工作思路清晰，数据详实，具有很高的科研价值与应用价值，为肿瘤的治疗提供了新的思路与方法。
文章鏈接
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-022-01619-4
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Arraystar human circRNA表觀轉錄組芯片
Ago-RIP PCR
RIP-PCR
