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IF15.8！客户文章|Arraystar circRNA芯片助力结直肠癌化学耐药性的分子机制研究

广东省人民医院胃肠外科李勇教授长期从事结直肠癌相关研究，课题组采用Arraystar circRNA芯片篩選發現，环状RNA分子circPDIA3在奥沙利铂（OXA）耐药性结直肠癌患者的肿瘤组织中显著上调。细胞和实验结果显示，敲低circPDIA3可使耐药细胞对OXA敏感，而过表达则降低了细胞对OXA的耐药性，临床研究显示circPDIA3能够作为生物标志物预测结直肠癌患者对OXA的耐药以及预后情况；在分子机制方面，作者发现circPDIA3通过直接结合细胞焦亡关键因子GSDME蛋白中的GSDME-C结构域，从而抑制细胞焦亡；并且，circPDIA3的表达还受到转录因子XBP1的调控，而circPDIA3又可以通过ceRNA海绵作用吸附miR-449a增强XBP1的表达，形成一个正反馈回路。这些发现揭示了circPDIA3在结直肠癌中的化疗耐药作用，提示circPDIA3可以作为克服结直肠癌患者OXA耐药的潜在生物标志物和治疗靶点。

该研究成果于2024年发表在学术期刊Drug Resistance Updates上，影响因子为15.8（Arraystar circRNA芯片由给我免费播放片高清在线观看生物|數譜生物提供技術服務）。

研究背景

结直肠癌（CRC）是全球第二大常见的恶性肿瘤，化学药物奥沙利铂（OXA）被广泛应用于结直肠癌的一线治疗，但临床上常出现OXA耐药，并引起结直肠癌复发。在OXA耐药性产生的分子机制中，存在多种生物学因素与之相关，其中细胞焦亡的异常调控是近年来研究的一大重点，阐明细胞焦亡的异常调控机制对CRC治疗方案的进一步优化具有重要意义。环状RNA（circRNA）是一类共价闭合单链形式的特殊ncRNA，由pre-mRNA经过反向剪接形成，这种特殊的结构使它们对RNA外切酶不敏感，在胞内胞外的稳定性更高；有越来越多的研究发现，circRNA在各类肿瘤的耐药性产生过程中发挥关键的调控作用，可以通过结合蛋白对蛋白的功能进行激活或抑制，也可以通过竞争性内源RNA（ceRNA）机制结合miRNA，调控下游基因的表达水平。这篇文章中，作者发现环状RNA circPDIA3在体内外均可通过抑制细胞焦亡来诱导CRC细胞的OXA化疗耐药性，为circRNA调控细胞焦亡诱导细胞耐药性的机制提供了新的见解，为优化创新CRC治疗方案提供了有前景的机制研究基础。

研究思路

文章着重于研究circPDIA3与细胞焦亡对结直肠癌在OXA耐药作用产生阶段的调控机制。作者运用Arraystar circRNA芯片技術檢測發現在OXA耐药的结直肠癌患者肿瘤组织中circPDIA3显著上调。进一步临床研究表明，circPDIA3表达与CRC患者的复发或转移率呈正相关，且circPDIA3高表达的患者具有较差的预后。在体内外实验中，作者证明了circPDIA3的过表达能够增强结直肠癌细胞的OXA耐药性；同时，circPDIA3能通过直接结合细胞焦亡的关键效应因子GSDME蛋白中的GSDME-C结构域，抑制细胞焦亡通路的激活。文章结果表明circPDIA3在结直肠癌OXA耐药性发生过程中扮演了重要的角色。

在功能研究中，作者发现在OXA处理CRC细胞或小鼠模型实验中，过表达circPDIA3可以促进OXA持续治疗下的肿瘤细胞生长，而抑制circPDIA3则导致肿瘤细胞被OXA诱导发生细胞焦亡，肿瘤组织体积减小；另外，作者还通过K-M曲线分析发现circPDIA3的高表达与结直肠癌复发和转移有关，能够作为诊断和预测结直肠癌患者预后情况的生物标志物。

在机制研究中，作者利用RNA Pull down-MS和RIP-PCR等實驗發現circPDIA3能够直接结合GSDME-C结构域，促进GSDME-C与另一结构域GSDME-N结合，抑制GSDME-N对细胞焦亡的触发活性，作者进一步验证了circPDIA3结合GSDME-C能够抑制蛋白的棕榈酰化修饰水平，进一步放大GSDME-C对GSDME-N的结合和抑制作用。另外，作者还发现circPDIA3的过表达增加了转录因子XBP1的表达水平，生物信息学预测、RNA Pull down-MS、双荧光素酶实验、RIP-PCR等實驗證明circPDIA3能够通过ceRNA机制吸附miR-449a上调XBP1的表达，而XBP1能够与PDIA3启动子结合并激活基因表达，又促进了circPDIA3的产生，形成了一个正反馈回路。总之，这些结果表明在OXA耐药的结直肠癌模型中，生物标志物circPDIA3的上调通过结合GSDME蛋白来抑制细胞焦亡，加速结直肠癌的耐药进程。

技術路線

結果展示

图1：circPDIA3在OXA耐药型的CRC患者肿瘤组织和细胞中显著上调。

A. Arraystar circRNA芯片热图显示OXA耐药型患者组织与敏感型组织的表达差异；

B. qRT-PCR验证circPDIA3在多种CRC细胞系中都有显著高表达。

图2：功能研究，验证circPDIA3表达水平对CRC细胞和组织耐药性的影响，以及circPDIA3作为生物标志物的潜力。

A. 过表达circPDIA3显著增强了肿瘤细胞在OXA处理下的增殖能力；

B. 抑制circPDIA3显著抑制了PDX模型肿瘤组织的生长能力；

C. 大样本PCR实验证明复发和转移的CRC患者组织的circPDIA3有显著更高的表达水平；

D. K-M生存曲线证明circPDIA3的表达与CRC患者的不良预后有显著相关。

图3：机制研究1，circPDIA3通过结合GSDME蛋白调控细胞焦亡。

A. RNA Pull down实验发现circPDIA3能够结合GSDME蛋白；

B. RIP-PCR验证circPDIA3与GSDME蛋白的结合；

C. 突变circPDIA3与GSDME结合的相关位点验证RNA-蛋白的结合；

D. CoIP实验证明circPDIA结合GSDME-C结构域，并且加强GSDME-C与GSDME-N的结合；

E. 敲低circPDIA3导致发生焦亡的细胞比例显著升高。

图4：机制研究2，CoIP验证circPDIA3结合GSDME-C并抑制蛋白的棕榈酰化。

图5：机制研究3，circPDIA3海绵吸附miR-449a调控XBP1表达。

A. 敲低circPDIA3显著降低了XBP1表达水平；

B. 多种生物信息学方法预测circPDIA3通过ceRNA机制结合的miRNA；

C. RNA Pull down验证circPDIA3与miR-449a的结合；

D. AGO-RIP-PCR实验验证circPDIA3与miR-449a的结合；

E. 过表达miR-449a验证miRNA对XBP1表达的下调作用和circPDIA3对XBP1表达的保护。

图6：机制研究4，XBP1结合PDIA3启动子调控circPDIA3表达。

A. 敲低XBP1发现circPDIA3表达水平被显著抑制；

B. 生物信息学预测XBP1与PDIA3基因启动子的结合位点；

C. CHIP-PCR验证XBP1结合PDIA3启动子的R1位点；

D. 双荧光素酶实验证明XBP1通过结合PDIA3启动子调节circPDIA3表达；

图7：作用机制图。

在结直肠癌细胞对OXA产生耐药性的关键时期，环状RNA分子circPDIA3表达显著升高，并与细胞焦亡关键激活蛋白HSDME-C结合，介导其与另一结构域HSDME-N结合、并且抑制HSDME-C的棕榈酰化，抑制细胞焦亡通路的激活，使肿瘤细胞在药物处理下继续存活，使转录因子XBP1表达显著上调，并通过正反馈进一步增强circPDIA3自身的表达，最终引起肿瘤细胞耐药能力的显著提高。

研究意義

本研究使用Arraystar circRNA芯片在OXA耐药型结直肠癌患者肿瘤组织中进行筛选，发现环状RNA分子circPDIA3显著上调，大样本验证和临床统计结果显示circPDIA3可作为生物标志物预测结直肠癌患者的复发和预后情况，对结直肠癌耐药、复发和转移的治疗都具有良好的理论价值。在实验结果中，作者通过一系列实验表明circPDIA3通过结合GSDME蛋白，抑制细胞焦亡的激活，从而促进结直肠癌细胞对化学药物OXA的耐药性产生，并且还能通过正反馈回路上调XBP1转录因子的表达进一步促进自身表达。这些发现深入研究了环状RNA分子circPDIA3在结直肠癌耐药性产生过程中的作用，并为结直肠癌治疗提供了新的潜在靶点。

原文出處

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1368764624000554?via%3Dihub

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